根据转录组数据得到新转录本通常涉及两个主要步骤：转录本组装和验证。 1. 转录本组装： 转录本组装是通过将转录组数据与参考基因组序列进行比对和拼接来确定各个转录本的序列。以下是一种常用的转录本组装方法： a. 数据预处理：去除测序错误、低质量序列和适当的适配器序列，以提高数据质量。 b. 对比对：使用比对工具（如TopHat、HISAT2等）将清洗后的转录组数据与参考基因组进行比对，以确定已知基因的外显子和内含子边界。 c. 转录本组装：使用组装工具（如Cufflinks、StringTie等）根据比对结果组装转录本，生成新的转录本序列。 d. 转录本定量：使用定量工具（如RSEM、Kallisto等）估计每个转录本的表达水平，以确定其在转录组中的相对丰度。 2. 转录本验证： 转录本验证是确认新转录本的真实性和与已知基因的关联性。以下是一些验证方法： a. RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）可以通过合成cDNA来验证转录本的存在。使用转录本特异性引物进行PCR扩增，并通过电泳分析验证预期大小的产物。 b. Sanger测序：通过使用Sanger测序技术对转录本的序列进行验证。在已知基因的外显子和内含子区域设计引物，扩增并测序验证新转录本。 c. RNA-Seq验证：使用独立的转录组测序数据集验证新转录本的存在。将新转录本序列与其他独立数据集进行比对，并检查是否有相应的reads支持其存在。 d. Ribosome profiling：利用核糖体测序技术，检查是否存在与新转录本相关的多肽产物，证明其在转录组中的翻译。 综上所述，通过转录组数据的组装和验证，我们可以得到新转录本，并通过验证方法确认其与已知基因的关联性。这些方法可以帮助我们更好地理解转录组的复杂性和基因表达的多样性。