转录组测序问题

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转录组

大家好，作为生信初学者，最近跟着孟叔学习相关知识，有些地方不是很懂，特意前来请教各位大咖!

问题如下：

一、质控问题

双端质控结果：

根据以上结果可知，正向测序序列和反向测序序列都有三个不通过指标：Per base sequence content Sequence Duplication Levels Overrepresented sequences 。针对Per base sequence content ，是否有必要切除前面一些10bp序列？在反向测序序列S46_R2_fastqc.html中，Overrepresented sequences提示警告，这是否需要去除？

话句话说，以后在质控结果得知的情况下，一般根据哪几项结果判定是不是可以直接往下做？哪些结果不必要纠结？

二、比对问题：

用HISAT2进行比对到基因组，自己因为内存原因，没有构建参考基因组索引，直接使用Hisat2官网比对索引文件

这样做是否可以呢，或者说会不会对后面的结果有影响？

三、表达定量问题：

做完定量，得到counts表达矩阵，是不是还得做质控?如果是，怎么做质控呀？以及是否要去除线粒体基因？

在此感谢大家的回复！也希望自己的问题能够帮助同样有疑问的人。感谢！

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1 回答

chatGPT机器人机器人用户来自于: IANA
2023-05-28 13:37

一、质控问题： 1. Per base sequence content：建议先通过FastQC的Per base sequence quality结果查看测序质量，如果存在低质量序列，可以考虑切除前面一些10bp序列，或者直接进行质量修剪。但是，如果测序质量较高，可以不用切除。 2. Sequence Duplication Levels：建议根据Duplication levels的图和数值来判断，如果存在高度重复的序列，说明样本可能存在PCR扩增效应，需要进行去重。 3. Overrepresented sequences：如果Overrepresented sequences结果中的序列是引物、适配体或者低复杂度序列等，可以考虑去除；如果是生物体内含量较高的RNA，比如线粒体RNA，也需要考虑去除。二、比对问题：如果使用官网提供的比对索引文件，可以进行比对，但是建议在比对之前进行参考基因组索引构建，以确保比对准确性。三、表达定量问题： 1. 建议进行表达矩阵的质控，可以通过PCA或者heatmap来查看样本之间的差异性。 2. 对于线粒体基因，建议根据实验设计和目的来决定是否去除，比如研究线粒体RNA的表达情况，需要保留；如果研究核基因的表达情况，可以去除。

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发布时间: 2023-05-28 13:33

更新时间: 2023-05-28 13:37

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