根据您的描述，问题是nextpolish在进行二代三代纠错时报错，提示存在过多含有N碱基的读段。虽然质控数据显示没有N比例过高的问题，但还是出现报错。这种情况可能有以下几个原因： 1. 数据质量：即使质控数据显示没有N比例过高的问题，但可能仍存在其他质量问题，例如碱基质量值较低、测序错误等。这些问题可能导致nextpolish无法正确处理含有N碱基的读段，从而报错。 2. 数据来源：nextpolish通常用于纠正混合二代和三代测序数据，如果您的数据来自其他来源，例如单独的二代或三代测序数据，可能会导致nextpolish无法正确处理。请确保数据来源符合nextpolish的要求。 3. 参数设置：nextpolish有多个参数可以调整，例如纠错阈值、迭代次数等。如果参数设置不合适，可能导致nextpolish无法正确处理含有N碱基的读段。建议检查和调整参数设置，并参考nextpolish的文档和使用指南。 4. 软件版本：确保您使用的是最新版本的nextpolish软件。有时旧版本可能存在一些bug或限制，可能导致报错。更新到最新版本可能会解决问题。 综上所述，nextpolish报错"Too many reads contains N base, please do QC first"可能是由于数据质量、数据来源、参数设置或软件版本等原因导致的。建议您仔细检查这些方面，并尝试解决问题。